常见问题

• 【知识科普】核酸提取的常用方法及原理

  目前常用的核酸提取方法有两种：一种是柱式提取，另一种是磁珠法提取。其中自动化提取的实现主要依赖于磁珠法。

  
  

  柱式提取是用于微量核酸提取的较为简单的方法，属于硅吸附方法的一种，市场上的离心柱虽各有特色，但在原理上通常可分为三个部分：

  (1)利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来。

  (2)把释放出的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附，因而在离心时被甩出柱子。

  (3)把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来，分离得到纯化的核酸。

  
  

  

  （柱式法图解）

  
  

  磁珠法提取运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的DNA和RNA分离出来，可应用在临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。

  
  

  
  

  

  （机器自动化磁珠法图解）

  
  

• 【核酸提取常见问题】核酸提取量过少是什么原因导致的？如何解决?

  核酸提取量过少，主要原因及解决措施如下：
  

  
  

  原因一：实验材料不佳或量少。

  解决方法：尽量选用新鲜（幼嫩）的材料。

   

  原因二：材料破壁或裂解不充分。

  解决方法：动植物要匀浆研磨充分；G+菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁；高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）。

   

  原因三：沉淀不完全。

  解决方法：(1)低温沉淀，延长沉淀时间。(2)加辅助物，促进沉淀。

  
  

  原因四：洗涤时DNA丢失。

  解决方法：洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。

  
  

• 【核酸提取常见问题】DNA降解是什么原因导致的？如何避免？

  DNA降解，主要原因及解决方法如下：

  
  

  原因一：材料不新鲜或反复冻融。

  解决方法：尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融。

   

  原因二：未很好抑制内源核酸酶的活性。

  解决方法：(1)液氮研磨或匀浆组织后，应站在解冻前加入裂解缓冲液。

                   (2)在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量。

   

  原因三：提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断。

  解决方法：细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

   

  原因四：被外源核酸酶污染。

  解决方法：所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。

   

  原因五：反复冻融。

  解决方法：将DNA分装保存在缓冲液中，避免反复冻融。

  
  

• 【PCR实验常见问题】无扩增产物（假阴性）的可能原因及解决方法有哪些？
  
  

  无扩增产物（假阴性）的可能原因及解决方法一览表
  序号	可能原因	解决方法
  1	模板含有抑制物或模板含量低	纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
  2	Buffer对样品不合适	更换Buffer或调整浓度
  3	引物设计不当或者发生降解	重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
  4	反应条件：退火温度太高，延伸时间太短	降低退火温度、延长延伸时间

  
  

  
  

• 【PCR实验常见问题】为何空白对照会出现目的扩增产物（假阳性）？如何避免？

  空白对照出现目的扩增产物，属于出现了靶序列或扩增产物的交叉污染，为避免这种情况发生，应注意以下几点：

  
  

  (1)实验操作时小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

  
  

  (2)除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

  
  

  (3)各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

  
  

• 【ELISA实验常见问题】试验结果白板，而且阳性对照不显色，可能原因及解决方法有哪些？

  试验结果白板，而且阳性对照不显色，常见原因以及解决方法如下：

  
  

  (1)可能原因：漏加或者误加试剂；

  解决方法：检查试验记录和剩余试剂。每次加液前均应核对标签。

  
  

  (2)可能原因：试剂过期；

  解决方法：使用有效期内的产品。

  
  

  (3)可能原因：洗板液配制中出现问题，如量筒不干净含HRP酶抑制物（叠氮钠等）；

  解决方法：使用干净的器皿，正确配制试剂。

  
  

  (4)可能原因：温育的时间或温度不够；

  解决方法：校正温育箱温度。

  
  

  (5)可能原因：标准品失活或者丢失；

  解决方法：标准品正确保存、溶解和混匀。

  
  

  (6)可能原因：抗体失活或者丢失；

  解决方法：更换抗体或者提高抗体浓度。

  
  

  (7)可能原因：酶失活或者丢失；

  检查方法：把工作浓度的酶再稀释20－100倍，取5uL加入50ul的显色底物，终止后显色是否能达到1.0左右，此为酶的粗略估计。

  解决方法：更换酶或者提高酶的浓度。

  
  

  (8)可能原因：显色底物失活；

  检查方法：加少量的工作浓度的酶，TMB是否很快显色。

  解决办法：更换显色底物。

• 【ELISA实验常见问题】实验结果空白背景高，是什么原因造成的？如何解决？

  ELISA实验结果空白背景高，常见原因如下：
  

  
  

  (a)可能原因：洗板不干净；

  解决方法：充分洗涤，彻底拍干；洗板要防止交叉污染；浓缩洗液准确配制；吸嘴尽可能一次性使用；加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。

  
  

  (b)可能原因：显色液变质或者试剂过期；

  解决方法：检查试剂盒有效期。

  
  

  (c)可能原因：试剂稀释有误，如加酶的浓度过高；

  解决方法：请按说明书所示稀释倍数配制；

  
  

  (d)可能原因：蒸馏水受酶等污染；

  解决方法：使用新鲜蒸馏水。

  
  

  (e)可能原因：试剂混用；

  解决方法：不同批号试剂勿混用。

  
  

  (f)可能原因：培养箱温度超过37℃或反应时间过长；

  解决方法：显色反应时间适当缩短。