【产品名称】禽流感病毒通用型和H5亚型双重荧光RT-PCR 检测试剂盒(荧光RT-PCR法) 

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于检测的扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织、全血等标本中禽流感病毒通用型和H5亚型RNA，适用于禽流感病毒通用型和H5亚型感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，通过设计一对禽流感病毒通用型和H5亚型特异性引物，各结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对禽流感病毒通用型和H5亚型的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

备注：不同批号的试剂盒组分不宜交叉使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融≤5次，有效期12个月。

【适用仪器】

ABI系列 、安捷伦MX3000P/3005P、Bio-Rad等系列荧光定量PCR检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀动物，取分泌物、血液、脾脏、扁桃体、肾脏和淋巴结等

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；全血样本：待血凝固后，取血清100μL于1.5mL灭菌离心管中。

1.2 核酸提取

按照相应RNA核酸提取试剂盒进行核酸提取，核酸提取产物-20℃保存。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照，每个测试反应体系配制如下表：

3. 加样（样本处理区）

将步骤1提取的RNA、阳性质控品、阴性质控品各取5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；

荧光通道选择： 检测通道AIV-U选择FAM， AIV-H5选择HEX，淬灭通道选择NONE，参比荧光选NONE。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定

5.2 设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.3 结果判断

阳性：检测通道Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道Ct值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现Ct值≤35.0和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无Ct值且无明显的扩增曲线。

6. 质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线或无Ct值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤30；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7. 检测方法的局限性

Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

Ø 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

Ø 所有操作严格按照说明书进行；

Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

Ø 反应液应避光保存；

Ø 反应中管盖需盖紧；

Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

Ø 实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

Ø试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。