Product details

非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒

检测方法:荧光PCR

产品规格:50T

保存条件:-20℃±5℃,避光保存

有效期:12个月


  • 产品介绍

    产品名称】非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒(荧光PCR法)


    【包装规格】50T/


    【预期用途】

    本试剂盒适用于检测的扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织、全血等标本中非洲猪瘟病毒DNA,适用于非洲猪瘟病毒感染的辅助诊断。


    【检验原理】

    本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术,通过设计一对非洲猪瘟病毒特异性引物,结合一条特异性探针,用荧光PCR技术对非洲猪瘟病毒的核酸进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。


    【试剂组成】

    名      称

      规      格

    Taq酶液

    25μL×1管

    ASFV反应液

    1100μL×1管

    ASFV阳性质控品

    200μL×1管

    阴性质控品

    200μL×1管

    备注:不同批号的试剂盒组分不宜交叉使用。


    【储存条件及有效期】

    -20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融≤5次,有效期12个月。


    【适用仪器】

    ABI系列 、安捷伦MX3000P/3005P、Bio-Rad等系列荧光定量PCR检测仪。


    【标本采集】

    病死或扑杀动物,取分泌物、血液、脾脏、扁桃体、肾脏和淋巴结等


    【保存和运输】

    上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过6个月,标本运送应采用2~8℃冰袋运输,严禁反复冻融。


    使用方法】

    1. 样品处理(样本处理区)

    1.1样本前处理

    组织样品:每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g,手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中,8000rpm离心2min,取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中;全血样本:待血凝固后,取血清100μL于1.5mL灭菌离心管中。

    1.2核酸提取

    按照相应DNA核酸提取试剂盒进行核酸提取,核酸提取产物-20℃保存。

    2. 试剂配制(试剂准备区)

    根据待检测样本总数,设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照,每个测试反应体系配制如下表:

    试剂

    ASFV反应液

    酶液

    用量(样本数为N)

    20μL

    0.5μL

    3. 加样(样本处理区)

    将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。

    4. PCR扩增(核酸扩增区)

    4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内;

    4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为25μL;

    荧光通道选择: 检测通道选择FAM, 淬灭通道选择NONE,参比荧光选NONE。

    4.3推荐循环参数设置:

    步骤

    循环数

    温度

    时间

    收集荧光信号

    1

    1 cycle

    95℃

    3min

    2

    40 cycles

    94℃

    15sec

    55℃

    30sec

    5. 结果分析判定

    5.1结果分析条件设定

    5.2设置Baseline和Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节),以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。

    5.3结果判断

    阳性:检测通道Ct值≤35.0,且曲线有明显的指数增长曲线。

    可疑:检测通道Ct值>35.0,且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验,重复试验结果出现Ct值≤35.0和典型扩增曲线者为阳性,否则为阴性。

    阴性:样本检测结果无Ct值且无明显的扩增曲线。

    6. 质控标准

    阴性质控品:无明显扩增曲线或无Ct值显示;

    阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且Ct值≤30;

       以上条件应同时满足,否则实验视为无效。

    7. 检测方法的局限性

    Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;

    Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;

    Ø 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;

    Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;

    Ø 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;

    Ø 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;

    Ø 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。


    注意事项】

    Ø 所有操作严格按照说明书进行;

    Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;

    Ø 反应液应避光保存;

    Ø 反应中管盖需盖紧;

    Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;

    Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;

    Ø 实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;

    Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。