【兽药名称】非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒

【主要成分与含量】

【作用与用途】用于猪全血、血清、脾脏、淋巴结、肌肉等组织样品及粪便样品中非洲猪瘟病毒DNA的检测。

【用法与判定】

1  用法

1.1  样品采集、保存及运输

1.1.1  样品采集

1.1.1.1  活猪样品  无菌采集EDTA抗凝血，或采血后按常规方法分离血清。

1.1.1.2  病死猪或屠宰猪样品  无菌采集脾脏、淋巴结、肌肉等组织样品。

1.1.1.3  病猪所处环境样品  采集粪便样品。

1.1.2  样品保存  所有待检样品在2～8℃保存应不超过24小时；在-20℃保存应不超过6个月；长期保存时，以-70℃以下为宜。

1.1.3  样品运输  样品一定要放置在有干冰或冰块的冷藏包中，保持全程冷链运输。要求在运输至实验室时，干冰仍覆盖标本或冰块仍未完全融化。

1.2  样品处理

1.2.1  抗凝血和血清处理  取抗凝血或血清200µl，置1.5ml灭菌离心管中。

1.2.2  组织样品处理  分别从待检组织三个不同的部位称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀，再取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2分钟，取上清液200µl，置1.5ml灭菌离心管中。

1.2.3  粪便样品处理  取0.3g样品于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2分钟，取上清液200µl，置1.5ml灭菌离心管中。

1.2.4  阳性对照处理  取阳性对照200µl，置1.5ml灭菌离心管中。

1.2.5  阴性对照处理  取阴性对照200µl，置1.5ml灭菌离心管中。

1.3  病毒DNA的提取

1.3.1  取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入200µl消化液和20µl蛋白酶K，振荡混匀后，置56℃水浴中消化，每5分钟涡旋振荡一次，共消化15分钟。

1.3.2  从水浴锅中取出样品管，降至室温后，加入200μl DNA结合液，颠倒混匀，将全部液体移入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱），室温静置3分钟，10000r/min离心30秒。

1.3.3  弃去收集管中液体，加入500μl DNA洗涤液，10000r/min离心30秒。

1.3.4  重复步骤1.3.3。

1.3.5  弃去收集管中液体，10000r/min空柱离心1分钟，以除去残留的DNA洗涤液。

1.3.6  将吸附柱放入新的1.5ml离心管中，向柱中央加入DNA洗脱液50μl，室温放置2分钟，10000r/min离心30秒，离心管中液体即为模板DNA。

1.4  实时荧光PCR操作

1.4.1  反应体系配制  设被检样品、阴性对照和阳性对照的份数总和为N，按如下反应体系配制：  

        将以上配制的反应体系充分混匀后，分装至每个反应管中各19µl。分别取1.3.6中DNA 1µl，加入相应反应管中，盖紧管盖后5000r/min离心30秒。

1.4.2  扩增  将反应管放入荧光PCR仪内，记录样本摆放顺序。反应参数为95℃预变性2分钟；95℃变性5秒，58℃退火延伸15秒，共40个循环，荧光收集设置在每次循环的退火延伸结束时进行（报告基团“FAM”，淬灭基团“NONE”）。

2  判定

2.1  结果分析条件设定  阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数即为Ct值。

2.2  结果成立条件  阳性对照Ct值＜30并出现特异的扩增曲线，阴性对照无Ct值且无特异的扩增曲线，试验结果成立。

2.3  结果判定

2.3.1  被检样品Ct值≤35并出现特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性。

2.3.2  被检样品无Ct值或Ct值≥40且无特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性。

2.3.3  被检样品35＜Ct值＜40并出现特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸疑似，对疑似样品，需重新取样提取DNA，按双倍模板量（即2µl DNA）进行复检，Ct值＜40并出现特异的扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。

【注意事项】  

（1）所有试剂应在规定的温度下保存。

（2）实验室应分配液区、模板提取区和扩增区。工作流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。各区器材试剂专用，不可跨区使用。实验结束后立即用1%次氯酸钠或75%酒精或紫外灯消毒工作台。

（3）PCR扩增反应液应置于冰盒上使用，其余冷冻保存的试剂使用前应室温融化，再8000r/min离心15秒，使液体全部沉于管底。用毕所有试剂立即放回原处。

（4）离心管、吸头等在实验前应全部高压灭菌。用灭菌的镊子夹取离心管，打开和盖上离心管盖时避免手和手套接触离心管口，若离心管开盖时有液体粘在手上或溅出，应立即更换手套。

（5）提取的样品，短期内使用放置于2～8℃或冰上，长期应在-70℃以下保存，但仍以新鲜提取的样品效果最好。

（6）反应体系在特定配液区配制，配制和分装反应体系时应尽量避免产生气泡，上机前，5000r/min离心30秒，检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器，整个实验过程应严格控制污染。

（7）严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时、转速等全部参数必须精确。

（8）注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，不同批次试剂盒之间的组分不要混用。

（9）所有用于检测的废弃物品均应放入含消毒液的废物缸内，高压灭菌处理。

【规格】50份/盒

【批准文号】兽药生字191538869