知识科普|兽医生物制品中常用灭活剂和冻干保护剂研究进展

  • 发布时间:2022-04-08
  • 文章来源:莱孚生物

灭活剂是指能致死细菌或病毒,使其失去复制能力或致病力(毒力)的化学物质。冻干保护剂是指冷冻真空干燥的生物制品中抗原活性物质以外的添加物。灭活和冻干对生物制品的抗原含量、核酸含量、免疫原性、稳定性和保存期影响较大。不同灭活和冻干技术的原理并不同,需根据微生物类型和制备目的,针对性选择适用的灭活剂和冻干剂。

(一)灭活剂

生物制品意义上的灭活是指利用物理或化学方法,破坏微生物生物学活性,使其丧失繁殖能力和致病能力,但仍然保留反应原性和免疫原性的过程。目前多用化学方法进行微生物的灭活,用来灭活的化学试剂或药物等称为灭活剂( inactivator ) 。使用化学灭活剂进行灭活是制备灭活疫苗最重要的手段,化学灭活剂的灭活效能与使用剂量、灭活时间、灭活时的温度及溶液的pH等都与灭活疫苗的质量密切相关。


1.β-丙内酯

β-丙内酯(BPL)对病毒有较强的灭活作用,其作用机制不是直接作用于壳蛋白,而是通过改变微生物核酸结构达到灭活的目的。大剂量BPL是一种潜在的致癌物,但其极易水解。BPL灭活周期短,经济效益高,但相较甲醛价格较高;对病毒有较强的杀灭作用,低质量浓度的BPL(2~4mg/L)可以破坏病毒核酸,但不改变病毒蛋白质。试验结果显示:BPL对禽流感病毒的最佳灭活条件为1:3000灭活24h,或1:1000灭活18h;对H9N2亚型AIV灭活能力强,对血凝素影响小,易水解成无害无残留产物;分别以BPL、甲醛为灭活剂制备H9N2亚型AIV灭活疫苗,免疫SPF鸡和广西土鸡,其免疫效果接近。


2.甲醛

甲醛是最古典和应用最广的灭活剂。早在1911年,Lowenstein和Eisler就开始用甲醛处理破伤风毒素。1924年,Puntoni以0.1%甲醛制成犬瘟热疫苗。甲醛为无色气体,易溶于水和乙醇,水溶液称为福尔马林,通常浓度为36%-40%,有强烈的刺激性。长期低温或受冻保存,可以聚合而成三聚甲醛或多聚甲醛。

甲醛对微生物核酸和蛋白都有破坏作用。甲醛可与核酸中腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶等含氨基碱基结合,使微生物核酸变性;与微生物蛋白的氨基结合形成羟甲基衍生物或二羟甲基衍生物,后者与酰胺交联,使微生物蛋白变性,从而阻止其核酸逸出。甲醛灭活微生物也存在一些缺点:作用于病毒壳蛋白时,容易与酰胺交联形成屏障而使作用于核酸的效率下降,导致灭活周期较长;灭活效果容易受到温度、pH、微生物种类、浓度的影响;具有致癌性,会使机体产生刺激反应。甲醛对单链核酸最有效,因此常被用来灭活RNA病毒。适当浓度的甲醛可使被灭活微生物的抗原性和血凝性保持不变。根据AIV灭活试验,发现用0.1%的甲醛灭活AIV16h后,病毒全部死亡,18h为最佳灭活时间。


3.烷化剂

烷化剂(alkylating agent)是含有烷基的分子中去掉一个氢原子基团的化合物,它能与另一种化合物作用,将烷基引入,形成烷基取代物。这类化合物的化学性质活泼,其灭活机制主要在于烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等,引起单链断裂或双螺旋链交联,妨碍RNA的合成,从而抑制细胞的有丝分裂。也可与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸的代谢。

烷化剂主要包括二乙烯亚胺(BEI)、乙酰基乙烯亚胺(AEI),是常用灭活剂,化学性质活泼。烷化剂可以与蛋白质相互作用,破坏蛋白质高级结构,使病毒完全丧失传染性,但不损伤表面结构蛋白,从而保留其抗原性,因此是制备灭活病毒疫苗的良好灭活剂。目前,用BEI灭活制备的疫苗已使用于动物中,尚未在动物体内发现BEI残留。烷化剂作为灭活剂,对生产成本、保存条件要求较高,对细菌灭活效果一般。

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(二)冻干保护剂

在食品、药品以及生物体的冷冻干燥和储藏过程中,很多因素(如化学成分、冻结速率、冻结和脱水应力、玻璃化转变温度、干燥固体中剩余水分、储藏环境的温度和湿度等)都会影响其中活性组分的稳定性,甚至会导致失活。大量的实验研究表明,除了一些食品、人血浆、牛奶等少数物料可以直接冷冻干燥外,大多数的药品和生物制品,都需要添加合适的冷冻干燥保护剂和添加剂,配制成混合液后,才能进行有效的冷冻干燥和储藏。按保护剂功能和性质分类可分为:冻干保护。即在冻结和干燥过程中,可以防止活性组分发生变性的物质;填充剂。能防止有效组分随水蒸汽一起升华逸散,并使有效组分成形的物质;抗氧化剂。用作防止生物制品在冷冻干燥过程以及储藏过程中发生氧化变质的物质;酸碱调整剂。在冷冻干燥过程和储藏过程中,能将生物制品的pH调整到活性物质的最稳定区域的物质。

冻干保护剂的主要作用机制:将病毒冻结,使其中冰晶升华,从而达到低温脱水,防止活性物质流失结构水的目的,以降低对生物活性的影响;降低胞内外渗透压差,维持细胞活力;保护或提供病毒恢复所需营养物质,使活性物质自我修复。在选择冻干保护剂时,要考虑保护核衣壳结构蛋白结构和核酸稳定性。常用的冻干保护剂有糖类、氨基酸、蛋白质和大分子明胶等。碳水化合物和蛋白质是生物制品相关研究中最为常见的两种保护剂。对多品种生物制品分析发现,因微生物(或抗原蛋白)结构特点各不相同,适用于它的冻干保护技术也不同,所以没有一种通用于各种生物制品的“万能”保护剂。 


1.糖类保护剂

糖类在微生物冻干过程中的保护作用机制有两种假说:一是糖类的羟基在干燥和脱水过程中与蛋白质的极性基团形成氢键,进而取代蛋白质上的水分子,形成一层水化膜,防止氢键暴露,从而稳定蛋白质的高级结构,维持病毒的抗原性;二是含糖溶液在冻干过程中会玻璃化,而糖类所处的状态为玻璃态。在玻璃态下,糖类保护剂黏度较高,分子扩散系数较低,因而会将蛋白质分子包裹,形成一种碳水化合物玻璃体,从而维持了蛋白质分子结构,起到保护作用。

研究表明:单糖中,半乳糖的保护效果最佳;二糖的保护效果普遍较好;三糖中的棉子糖对细菌的保护作用最好。另外,海藻糖和蔗糖用作保护剂时效果最好,当使用50g/L的海藻糖时,菌群存活率达到83%左右,当使用100g/L的蔗糖时,存活率达到75%左右。此外,海藻糖分子较小,能填补蛋白质分子的空隙,有效限制蛋白质分子内部结构变化,从而起到保护病毒蛋白外壳的作用。

 
2.氨基酸保护剂

在冷冻过程中,低浓度的甘氨酸可以抑制由于磷酸缓冲盐结晶所致的pH变化,并防止蛋白质变性。结晶型甘氨酸的主要作用是提升冻干品的塌陷温度,防止破坏蛋白质结构。常见氨基酸保护剂主要包括精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸钠、色氨酸、酪氨酸。研究发现,2%谷氨酸钠、2%L-精氨酸盐酸盐、2%D-山梨醇、7.6% 酶解酪蛋白、1%海藻糖、4%明胶、15.2%蔗糖、2%牛血清白蛋白的配方,可使猪伪狂犬病病毒冻干保护率达到80.40%。


3.蛋白质保护剂

蛋白质保护剂主要包括脱脂乳、血清白蛋白、大豆蛋白、胶原蛋白,其能够阻止病毒蛋白质表面吸附,从而对冻干过程中多数蛋白都能起到保护作用。此外,蛋白质可以在微生物细胞外形成保护,在冷冻干燥过程中,蛋白质溶液中的保护剂与蛋白质分子之间相互作用,增加冷冻混合物的玻璃化转变温度,大大增加微生物蛋白质的稳定性。采用质量浓度为10.49%脱脂乳与4.22%葡萄糖混合后冻干副干酪乳酸菌,当冻干厚度为0.3cm时,菌体细胞存活率最高,达到94.90%。


小结

灭活和冻干是兽医生物制品生产中必不可少的技术之一。目前,我国大部分生物制品主要使用甲醛灭活。该方法技术成熟,价格低廉,但使用甲醛作灭活剂存在破坏免疫原性、有致癌风险、灭活时间长等问题,难以适应新型疫苗发展。虽然 新型灭活剂研究也已逐步开展,但大多仍局限于实验室研究阶段。冻干工艺技术直接影响生物制品的保存、运输和使用。由于不同保护剂的保护机制各不相同,单一保护剂不能满足微生物抵抗恶劣环境的需求,因此在冻干过程中常采用不同类型的保护剂,按照合适的浓度配比进行协同保护,从而强化保护效果,保证微生物存活率最大化。